01 工艺表征研究的扩展

在前序的Bio-share系列中，我们分享了一系列关于工艺表征研究相关的内容。通过常规的工艺表征思路和研究，可以积累产品和工艺的理解。然而，我们也发现并非所有的单元操作都能进行常规的工艺表征研究，比如那些不能精确建立缩小模型的单元操作（病毒灭活、制剂混合工艺等）。

最差条件研究可以作为此时工艺表征研究的扩展。PDA TR60技术报告中将最差条件定义为：一组工艺条件，包含工艺条件的上限或者下限，或者与理想工艺条件相比，会造成工艺或者产品最大潜在失败风险的工艺条件，但这些条件并不必定会导致产品或工艺的失败。

在工艺表征中，我们可以借助最差条件研究来进行：
1. 最差条件下的PC研究，建立产品和工艺知识；
2. 最差条件下的链接研究，确定工艺的稳健性；

02 最差条件研究的原理

使用最差条件研究，策略是最差条件下，进行影响某些CQA的单元操作，并评估CQA的输出是否在工艺正常可接受范围内。如果结果在CQA的可接受范围内，那就证明在单元操作的整个操作范围内，工艺均是可行的。如果结果超出了CQA的可接受范围，那就意味着需要对单元操作缩小一个或多个工艺参数的可接受范围。

03 最差条件的确定

可以通过两种方式确定单元操作的最差条件：

• 基于单元操作的工程知识。比如低pH病毒灭活单元操作，可基于工程知识确定在高pH、短保持时间、低温度、高蛋白浓度下对于病毒灭活为最差条件。而低pH、长保持时间、高温度、高蛋白浓度对于产品质量（比如聚集体）为最差条件。
• 基于PC研究研究。可以使用PC研究确定对特定CQA产生影响的工艺参数，工艺参数的设置方向可基于回归模型的最差条件预测。如下案例所示：

案例：基于对蛋白A亲和层析步骤的PC研究，研究参数包括上样载量、淋洗体积、洗脱pH和流速。

PC结果可获得HCP的回归模型为：
HCP（ppm） = 5823 – 227.4*载量 – 585.6*pH -2.1*流速 + 4.4*载量²
因此，对于蛋白A亲和层析步骤去除HCP的最差条件为：载量低点、pH低点和流速低点，淋洗体积无影响，可选择中心点。

04 最差条件下的PC研究

以低pH病毒灭活步骤为例，对产品聚集体的表征，可选择pH3.2，蛋白浓度35g/L，温度25℃，研究不同工艺操作时间对聚集体的影响，基于聚集体的可接受范围确定上述工艺参数的可接受范围。

表1. 低pH病毒灭活步骤中聚集体的最差条件研究

对于病毒灭活，pH4.0，蛋白浓度35g/L，温度15℃是最差条件，PC研究工艺时间在60-180min内是否实现稳健的XMuLV灭活。

基于上述两个最差条件的研究，可确定低pH病毒灭活步骤下的工艺参数设计空间。

图1. 低pH病毒灭活步骤的设计空间

05 最差条件下的链接研究

当某些CQA受不止一个单元操作的影响时，需要进行最差条件的链接研究，可以展示生产工艺的稳健性。

根据上述描述的方法来确定单元操作的最差条件。有些单元操作具有固有的工艺稳健性，即不包含影响该CQA的工艺参数，那这些单元操作在链接研究中可在目标条件下运行。

图2. 最差条件下的链接研究的设计

经过链接实验研究，最终工艺产品能够获得可接受的产品质量，则可以确认整个工艺中设计空间的有效性。然而，如果最终产品无法获得可接受的产品质量，那么需要对工艺参数进行进一步的限制，可以：
1）在一个或多个单元操作中缩小一个或多个工艺参数的可接受范围，以防止CQA超过其CQA-TR；
2）利用对参数影响大小和相互作用的理解，不允许将来使用这些工艺参数组合产生不可接受结果的值。后一种方案将允许在生产过程中具有更大的操作灵活性，但需要定义影响CQA的工艺参数值之间的关系以及一个更加清晰的工艺，以确保对PALM计划内累积或顺序工艺参数目标变化进行适当管理。

06 最差条件研究的改进

上述描述的最差条件链接方法是一种非常保守的方法，因为它在整个过程中结合了最差条件设置。可以理解，最差条件下的链接在证明生产工艺能够提供可接受的产品质量方面具有理论价值。然而，这种知识的实用价值是有限的，因为将所有工艺参数目标组合在其最差条件设置下运行，对于常规商业生产是不现实的。

因此，可以改进最差条件研究以获得更科学合理的工艺评估：

• 单元操作最差条件链接研究：这是一项链接研究，用于评估一个单元操作工艺参数设定点的最差条件组合。在由目标工艺参数设定点组成的代表性工艺条件下，对生成的收集液进行下游处理。对所有相关产品质量属性重复单元操作最差条件链接研究。
• 基于模型的链接计算：作为对试验单元操作最差条件链接的补充，该评估使用一个单元操作工艺参数设定点的最差条件组合，并使用工艺模型预测由目标工艺参数设定点组成的代表性工艺条件下下游处理的结果。
• 挑战性研究：在上游收集液中未观察到杂质水平升高的情况下，工艺相关杂质的挑战性研究可用于证明去除特定杂质去除（如DNA）的工艺稳健性。
• 精细纯化步骤去除研究：该研究通过跳过某个单元操作的实验，从而证明了CQA的充分去除，从而证明了工艺稳健性。

图3. 最差条件研究的改进

07 总结

最差条件研究是工艺表征研究的重要扩展，可以获得更多的产品和工艺知识。基于最差条件的确定，可以进行PC研究，也可以进行链接研究。链接研究的结果可指示工艺的稳健性，同时反馈工艺参数的合理设计。

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