除了理化特性之外，活性测定是抗体药物质量评价体系中必不可少的部分。生物活性测定是对抗体药物有效成分的含量和药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质量控制指标，因而需要建立完整的体系进行表征。一般而言，活性测定包括生物学活性测定和结合活性测定。

生物活性测定

抗体药物生物活性检测的基础是抗体药物生物活性的发生机制。比如CD20抗体（如利妥昔单抗）与表达细胞表面CD20结合，通过ADCC等效应，杀伤靶细胞。而PD-1单抗（如Keytruda）通过阻断PD-1和PD-L1的结合，恢复耗竭的T细胞的效应活性，杀伤肿瘤细胞。因为不同抗体药物发挥效应的机制不同，需要建立不同的生物活性测定方法。常用的生物学活性测定包括：ADCC、CDC、抑制细胞增殖、细胞毒性、细胞因子分泌能力、内化作用等。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性

（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity ,ADCC）

抗体药物的Fc段通过与效应细胞（最主要是NK细胞）表面的Fc受体（如FcγRIIIa/CD16）结合，介导效应细胞杀伤肿瘤细胞。因而经典的ADCC检测方法是制备外周血单个核细胞（PBMC），直接进行效应细胞杀伤实验。但是因为PBMC本身异质性强，整个操作过程繁琐，结果背景高，会对评价实验结果带来诸多不便。

抗体依赖性细胞介导荧光素酶报告基因法-ADCC：抗体Fc段结合FcR会激活NFAT信号通路，因而近年来开始使用荧光素酶报告基因法来进行ADCC评价。比如CD20抗体ADCC评价，使用WIL2-S细胞系作为靶细胞，使用基因工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，该细胞表达FcγRIIIa和NFAT应答元件驱动的荧光素酶报告基因，当抗体将效应细胞和靶细胞连接在一起时，NFAT被激活，通过荧光素酶化学发光信号可以反映抗体的ADCC效应，此方法简单、专属性好、细胞系均一性好、准确度高。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒法-ADCC：抗体的Fc段和经过改造NK细胞的FcγR结合使NK细胞激活，诱导效应分子的释放，其中包括穿孔素、颗粒酶和肿瘤坏死因子等诱导细胞凋亡。适用抗体药物：CD20抗体、CD38抗体、HER2抗体、GD-2抗体等

补体依赖的细胞毒性CDC

Complement-dependent cytotoxicity (CDC)

抗体药物的Fc和补体C1q结合，会在靶细胞表面形成膜攻击复合体（membrane attack complex，MAC)，造成细胞外离子大量内流，引起肿瘤细胞裂解。

CDC活性测定，是将重组抗体进行系列稀释后，与靶细胞进行孵育，在补体存在的情况下，抗体药物会在靶细胞表面形成膜攻击复合体，导致细胞溶解，采用检测细胞存活的试剂，可以对CDC作用效果进行评价。

适用抗体举例：CD20抗体、CD38抗体、CD52抗体等。

细胞增殖抑制实验

生长因子类靶点（如VEGF、HER2、EGFR）的抗体药物，通常通过阻断靶点和其受体的结合，从而抑制生长。因而在进行生物学活性测定时，可以采用细胞增殖抑制实验来测定。如贝伐珠单抗（VEGF抗体）可以使用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖抑制法，曲妥珠单抗（HER2单抗）可以使用表达HER2的乳腺癌细胞系进行增殖抑制实验，如BT474等。西妥昔单抗（EGFR抗体）可以使用表达EGFR的肿瘤细胞系，如A431等。

细胞因子测定

如前文所述，PD-1抗体或者PD-L1抗体，可以阻断PD-1和PD-L1的结合，恢复T细胞的效应功能。T细胞分泌系列细胞因子如TNF-α、IFN-γ等的能力增强，因而检测细胞因子分泌可以反映抗体药物的生物活性。

检测细胞因子有多种方法，其中最简单的细胞因子测定方法是ELISA法，可以通过检测细胞分泌上清中的单个细胞因子。也可以使用ELIspot和流式细胞术检测分泌细胞因子的细胞。有时为了更好评价抗体药物的功能，需要检测一个细胞因子panel，则可以选用流式细胞术 CBA法或Luminex 液相芯片技术。如果对于灵敏度有要求，则可以考虑选择电化学发光法。

结合活性测定

抗体药物通过Fab段CDR区结合抗原，Fc段结合FcR，结合C1q，结合FcRn等，是抗体发挥其生物学活性的基础，因而测定抗体的结合活性，可以部分反映抗体的活性。常用的方法包括表面等离子共振测定，生物膜层干涉法，时间分辨荧光和apha技术等。

表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance）测定法

Wood等人在1902年发现了由表面等离子体波激发引起的异常衍射现象。表面等离子共振，是指光源发出的一束入射光从高折射率介质射向低折射率介质的界面时，如果入射角大于一定的临界角，入射光将被100%地发射至光源的同一侧，这叫做全内反射现象，当两种介质之间有一层金属膜时，入射光的能量将会引起金属膜中等离子体共振，并以电磁场的方式弥散至低折射率介质一侧，从而导致反射光的能量在某个特定的角度降至最低，这一角度称为SPR dip角。

任何药物发挥作用都涉及到药物和靶点分子之间的结合，而表面等离子共振作为一种生物传感器技术，在此领域有广泛的应用。

当分子间发生结合或者解离时，会定量改变膜表面附近分子的浓度，从而导致金属膜附近折射率的变化，导致SPR dip角发生改变，因而通过实时监测角度变化，可以检测结合和解离过程。

Adv Protein Chem Struct Biol . 2018;110:1-30.

生物膜层干涉（Bio-Layer Interferometry ,BLI）测定法

生物膜干涉技术（BLI）实时监测分子间相互作用是通过生物传感器来实现的，生物分子A结合到光纤材质的生物传感器末端会形成一层生物膜，当传感器末端的分子A与待检测分子B结合时会引起传感器末端分子量的改变，从而导致生物膜厚度的改变。光通过传感器的生物膜层后会发生透射与反射，反射光的频率受到生物膜层厚度的影响。一些频率的反射光会与入射光产生相长或相消干涉。这些干涉光波被光谱仪所检测到，并形成一幅干涉光谱,并以干涉光谱的相对位移（nm）显示出来。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反应出传感器表面生物膜的厚度。

均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence HTRF）

HTRF结合了荧光共振能量转移（FRET）和时间分辨荧光（TRF）两种技术，具有背景低，灵敏度高，通量大等特点。当供体和受体（可以理解为抗体和抗原或者抗体和受体）距离较近时，供体和受体之间发生荧光共振能量转移而产生信号。因为采用双波长检测，能够显著减少缓冲液，培养液等的干扰。

总结

抗体药物在完成理化属性的分析之后，需要对其活性进行全面的表征。结合活性可以直接的反映抗体结合抗原的能力，以及与效应分子/受体的结合能力，如FcγRIII，C1q等。在此基础上，通过细胞学生物活性测定，如ADCC、CDC、细胞增殖抑制、细胞毒性、细胞因子分泌，内化作用等，组成了体外检测抗体活性的全面表征体系，是抗体药物进入活体实验的基础，和临床实验获得成功的保证。

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参考资料

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