1976年单克隆抗体技术被Georges Köhler和 César Milstein发明，之后经历了鼠源、嵌合、人源化和全人源 4 个主要发展阶段，由于鼠源和嵌合单抗会产生人抗鼠抗体反应，所以人源化和全人源单抗已成为生物技术企业研发的主流。单抗的分子量高达 150 kDa 左右，结构复杂，其质控相比较于小分子药物要求更高。

以单抗技术为基础，又相继开发了抗体偶联药物、多特异性抗体药物、纳米抗体等多种新兴技术，如何全面表征抗体药物的关键质量属性，成为抗体药物开发的关键点和难点。本系列文章分为上下两篇，上篇重点是理化属性，集中在抗体药物结构、电荷及分子量大小变异体、糖异质性、工艺相关杂质、聚集体分析，下篇重点为活性分析，包括结合活性和生物学活性等。

理化属性表征

1. 抗体药物结构

抗体药物结构表征主要包括以下参数：

1) 完整分子量

2) 轻链分子量

3) 重链分子量

4) 氨基酸序列

5) 二硫键

6) 自由巯基

7) 糖基化位点

8) N-端测序

9) 翻译后修饰

10) 二、三级结构表征

在前9项一级结构表征中，LC/MS是最主要和最基础的表征方法，二三级结构涉及使用圆二色谱，红外光谱等，细节不作赘述。

抗体结构表征的目的，除了全面表征抗体药物质量，另外一个核心目标是寻找可能影响抗体药物疗效的关键氨基酸残基、关键氨基酸的翻译后修饰，进行相关工艺改造和确认，避免在工艺开发后期以及临床阶段，产生不良影响，也是本文主要的讨论内容，主要包括：脱酰胺，异构化，Met和Trp氧化，未配对的半胱氨酸等。

1.1 脱酰胺

天冬酰胺（Asn），尤其是CDR区的Asn残基脱酰胺，是单克隆抗体药物最常遇到的降解途径之一。当Asn后面是小的且活跃的甘氨酸（Gly）残基（NG基序）时，容易发生脱酰胺，并且如果发生在CDR区，会导致对抗原结合亲和力降低，抗体效力丧失。因而在抗体测序和生物信息学评估时，需要关注CDR区的Asn-Gly残基，并在强制降解阶段对其进行评估。

此外在IgG的Fc段“ PENNY”环肽中，也包含脱酰胺易感位点，但是因为通常不会对抗体药物结合抗原带来负面影响，一般不做重点关注。

1.2 氨基酸氧化

蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）残基容易发生氧化。其中重链CDR2中的蛋氨酸以及Fc区中的蛋氨酸氧化并不会影响抗原结合。但是当氧化水平较高，或者发生在抗原结合的关键CDR区域，会降低抗原结合能力，降低抗体药物的有效性。

靠近CH2-CH3区域的蛋氨酸残基易发生氧化，导致热稳定性下降，聚集增加，补体依赖性细胞毒性（CDC）下降，与FcRn的结合亲和力下降以及体内半衰期缩短。

CDR中Trp残基的氧化，可能导致有效性降低，热稳定性降低和聚集倾向增加。

总体而言，生物信息学分析和一级序列测定时，应重点关注CDR区Met和Trp的氧化，并确定它们的敏感性，必要时在工艺阶段采取适度控制策略。

1.3 Asp异构化

Asp异构化是单克隆抗体药物的另一种降解途径。CDR区的Asp残基，如果后面是Gly残基，His或Ser时，通常易于异构化。CDR区发生异构化，可能导致抗原结合亲和力降低。当pH值在5左右时，有利于Asp异构化，因此抗体药物的制剂配方开发时，需要注意其pH值尽可能避开5。

1.4 糖基化位点

IgG CH2 Asn-297连接的N糖为核心7糖结构，四个N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和三个甘露糖(Mannose)残基。根据抗体的功能需要，会对抗体的糖型进行改造，以获取相应的功能特性，以及延长或缩短抗体半衰期等。因而糖基位点检测分析贯穿于抗体药物工艺的整个过程，也是质量放行的关键质量属性。

Biologicals (2017)

抗体糖工程改造主要有岩藻糖基化，乙酰葡糖胺化，半乳糖基化，唾液酸化四种。

通过核心岩藻糖基转移酶(Fut8)催化N-聚糖GlcNAc核心岩藻糖基化；通过乙酰葡糖胺基转

移酶3(GNT3)在分支角Mannose上添加乙酰葡糖胺（GlcNAc）；通过β-1,4-半乳糖转移酶

1(b4GALT1)在七糖末端的两个GlcNAc添加半乳糖，使其半乳糖化。这三种策略是改变和1

型FcγR的结合。在核心岩藻糖基化以及半乳糖基化的基础上，在α2,6-唾液酸转移酶（ST6GAL1)，可以增加抗体的唾液酸化，唾液酸化则可以增加和2型FcγR的结合。

糖异质性分析，通常使用LC/MS对于糖型进行鉴定，使用HILIC-FLD进行糖型定量分析，使用硼酸亲和色谱进行糖化检测。

1.5 未配对的半胱氨酸（Cys）残基

未配对的半胱氨酸会增加抗体的异质性，并可能对化学和热稳定、生物功能、聚体形成，抗原结合效力和蛋白折叠产生重大影响。单克隆抗体在CDR区可能具有未配对的半胱氨酸（Cys）残基，不过比较少见。未配对的Cys很容易地在细胞培养基中被游离的半胱氨酸修饰，会降低抗原结合亲和力。因此，未配对的半胱氨酸应视为质量属性进行常规监测和表征，以确保结构完整性和产品质量。

2. 变异体分析

重组抗体在培养工艺、纯化、制剂等阶段都容易引入抗体大小变异体和电荷变异体。抗体大小变异体和电荷变异体是抗体鉴别和一致性评价的重要指标。

大小变异体检测常用方法包括分子量排阻色谱，CE-SDS（2015版药典收录，2020版做了修订）。

抗体药物的电荷变化反映了各种蛋白质翻译后修饰的总和，对工艺改变的过程非常敏感，在整个开发过程中都需要密切监测，以确保一致性。常用的表征方法包括离子交换色谱法和等电聚焦法（2020版药典收录），检测指标包括等电点和酸碱变异体。

3. 聚集分析

抗体分子因为翻译后修饰、运输等的剪切力、杂质、pH值变化等引起蛋白质空间改变，形成空间互补、电荷互补，易产生聚集体。聚集体（或聚集颗粒）是最常见的产品相关的杂质。抗体聚集会增加抗体药物免疫原性，促进抗药物抗体产生，降低药物疗效，所以需要进行密切监控。

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2011

常用的分析方法包括：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或毛细管电泳（CE-SDS），用于在变性条件下还原或非还原下测定mAb单体，片段和共价聚集体。体积排阻色谱法（SEC）也是确定单克隆抗体的高分子量聚集物（例如二聚体，三聚体或低聚物）的最常用方法。
对于大型聚集体（颗粒物），可以使用光散射来表征<1nm至1-10μm范围内的颗粒，比如常用的DLS方法，目前对于颗粒物，药典的检测方法包括光阻法（例如HIAC）和显微计数法。微流体成像技术，则被用于大于2-100μm的颗粒物，可以一定程度上区分蛋白质聚集颗粒物和其他异物。

4. 工艺相关杂质

工艺相关杂质，是指由生产工艺引入的杂质，主要包括宿主细胞残留的DNA和蛋白质，以及纯化时引入的蛋白A。宿主蛋白虽然不会引起严重的过敏反应等副作用，但确是工艺（尤其是纯化工艺）非常好的质控指标，所以一直是抗体药物表征的关键质量参数。

宿主DNA最常用的方法是定量PCR法，而宿主蛋白残留，一般推荐使用方法为ELISA法，但有时ELISA法的蛋白质覆盖度有不足，通常会结合使用质谱法和特定蛋白质的Western blot方法，以达到完整的覆盖。对于残留的蛋白A，通常使用ELISA法进行检测。

5. 一般属性

除去上述关键的质量参数，此外尚有pH值、渗透压、外观、粘度等指标用于表征抗体药物的一般属性，可以参考药典给出的标准方法进行测定。

小结

抗体药物因为分子量是小分子药物的数百倍，且因表达体系，工艺流程容易引入蛋白质翻译后修饰变化，大小变异体，电荷变异体，甚至会聚集形成颗粒等，对于质量表征提出了非常高的要求，本文分析了部分对于产品质量，尤其是会影响最终疗效的参数做了简要的梳理。

康日百奥分析实验室拥有Thermo Orbitrap Exactive HF-X液质联用仪，Thermo Vanquish UHPLC, Protein Simple Maurice, SCIEX PA800 plus, Waters ACQUITY H Class UPLC, Thermo CAD检测器, Malvern全自动毛细管差示扫描量热仪，Octet分子间相互作用仪，MD M5酶标仪，Roche480 qPCR仪等先进研究和检测设备，可对单克隆抗体，双抗，融合蛋白，ADC等生物药进行分析方法开发、确认和验证，并提供全面的蛋白表征研究（包含工艺可比性研究，生物类似药的相似性评价等）。，为抗体药物研发同仁提供优质的，可靠的服务。

主要参考资料

1. Xiaojie Yu et al，Improving Antibody-Based Cancer Therapeutics Through Glycan Engineering，BioDrugs DOI 10.1007/s40259-017-0223-8

2. Yingda Xu et al，Structure, heterogeneity and developability assessment of therapeutic antibodies，mAbs，2018

3. Cymer, F., Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation – Structure, function and therapeutic potential， Biologicals (2017), https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2017.11.001

4. Classification and Characterization of Therapeutic Antibody Aggregates ，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 286, NO. 28, pp. 25118–25133, July 15, 2011