双特异性抗体领域正在经历一场从Wet lab驱动向AI辅助设计的转变。至2026年初，已有16款双抗及1款双抗样融合蛋白在中美获批，其中15款用于肿瘤治疗。同时，下一代双抗的开发正越来越多地借助AI在靶点识别、结构预测和格式设计层面的能力^[1]。在这一背景下，TCR样抗体提供了一条突破传统抗体靶向边界的路径。传统抗体只能识别细胞表面的完整蛋白或糖类抗原，而TCR样抗体识别的是HLA分子呈递的胞内蛋白短肽片段，理论上可将约80%的胞内肿瘤抗原纳入靶向范围。2026年8月发表于mAbs的一项研究以癌睾抗原MAGE-A4为对象，通过酵母展示筛选、计算结构优先排序和实验验证相结合的策略，获得了一株识别HLA-A*02:01呈递的MAGE-A4肽复合物的TCR样抗体，并将其与抗CD16 VHH融合，构建了自然杀伤细胞衔接器（NKCE），在体外模型中验证了选择性杀伤活性^[2]。这一研究展现了AI辅助设计从结构预判，到抗体发现与工程化改造的完整路径，为实体瘤治疗中的应用提供了一个新的参考。

一、AI辅助设计：从盲筛到结构预判

在获得酵母展示筛选出的抗体克隆后，研究者需要区分哪些克隆真正识别的是肽-HLA复合物，而不是其余非特异性结合？

在这一情况下，AI辅助结构设计发挥了核心作用。研究者对15个候选scFv进行了同源建模和结合模式分类，将其分为三类：

• 典型对角线结合模式：CDR3同时接触α1和α2螺旋，深入凹槽与肽段形成特异性相互作用，展现出了具有治疗价值的结合方式。
• 偏倚结合模式：仅仅结合α1或α2螺旋，CDR3难以与短肽形成稳定相互作用。
• 非特异性结合模式：结合HLA框架区域而非肽结合槽，不具备靶点特异性。

通过AI预判结构设计，研究者将实验验证的资源集中在最有希望的克隆上。后续ELISA和流式细胞术证实了这一预判的可靠性：在细胞表面MAGE-A4/HLA-A*02:01阳性肿瘤系中，典型结合模式的克隆表现出明确的靶向结合，而偏倚或非特异性克隆则未显示有效结合。由此可见，AI在这一阶段有效地将实验资源从盲筛引导到精准验证，加速实验进程。

图1：人源化scFv变体的结构建模与结合验证，AI结构建模指导人源化改造和结合模式预判的实验证据

二、NK细胞衔接器：CD16靶向的平衡路径

T细胞衔接器（TCE）是目前双抗领域最成熟的亚类，但是T细胞过度激活可能引发细胞因子释放综合征和神经毒性，这在多发性骨髓瘤等适应症的TCE临床试验中，已成为需要关注的安全性问题。

而NK细胞提供了一条不同的路径。NK细胞天然具备杀伤肿瘤细胞的能力，无需预先致敏。且它不会分泌大量促炎细胞因子，因此理论上CRS和ICANS的风险更低。

该研究构建的MAGE-A4×CD16 NKCE，将TCR样抗体的人源化IgG骨架与抗CD16 VHH融合。CD16是NK细胞表面介导抗体依赖细胞毒性的核心受体，靶向CD16可独立于共刺激信号直接激活NK细胞。这一设计的意义在于，TCR样抗体提供了对胞内抗原的精准识别能力，且NKCE格式提供了一个更安全的效应细胞激活策略。这两者的结合，在靶点空间和安全性之间找到了一条新的平衡路径。

三、Fc沉默突变：NKCE设计中的关键工程

该NKCE分子引入了一个关键的Fc工程化改造：N297A突变。在IgG抗体中，Fc区域的糖基化位点（N297）负责维持Fc与FcγR的结合能力。N297A突变消除了这一糖基化位点，使Fc区域无法与NK细胞或其他免疫细胞表面的FcγR结合，从而阻断Fc介导的ADCC活性。

这样做的原因是，如果不引入Fc沉默突变，IgG骨架本身会通过Fc-FcγR相互作用非特异性地激活NK细胞，这种激活不依赖于抗体对肿瘤靶点的识别，可能导致脱靶毒性和全身性免疫激活。引入N297A后，NK细胞的激活就完全依赖于抗CD16 VHH与CD16a的特异性结合。研究者通过实验证实，亲本IgG格式在引入N297A后报告细胞激活显著降低，而含VHH的NKCE则保留了CD16a依赖的激活活性。

这一设计对双抗工程化具有一定的参考意义。Fc区域的保留与沉默，需要根据分子是否依赖Fc介导的效应功能来分别决策。对于以靶向衔接为主的NKCE，沉默Fc是避免非特异性激活的必要选择；而对于以ADCC为主要杀伤机制的分子，保留Fc则将是更优策略。

四、多价设计：从二价到四价的工程化考量

研究进一步构建了包含四个抗CD16a VHH的多价NKCE变体。多价设计的考量在于亲合力效应。肿瘤细胞表面的肽-HLA复合物密度通常远低于常规表面抗原，单价结合可能不足以触发有效的NK细胞激活。通过多价VHH促进CD16a受体在NK细胞表面的簇集，可以在靶抗原密度较低的情况下，仍然实现有效的信号传导。

然而，多价设计存在工艺层面的挑战。四个VHH结构域的串联，增加了分子的复杂性及分子量，可能影响表达效率、增加聚集倾向，并对纯化工艺提出更高要求。研究人员在文章中也指出，多价设计需要平衡“功能性的增强”与“可制造性”之间的关系，这也是后续开发中需要验证的关键参数。

五、总结

双特异性抗体正从T细胞衔接器向更广泛的免疫细胞衔接策略拓展，而AI辅助设计正在成为加速这一进程的关键工具。用结构建模预判结合模式，用Fc沉默突变控制激活特异性，用多价设计补偿靶抗原低密度。这些工程化决策相互关联，共同决定了最终分子的功能性表现。

面对可能遇到的工艺问题，在我们的实际交付中，针对双抗、三抗等多特异性抗体在结构与表达方面的复杂性，我们逐步建立并完善了一套平台化的开发体系，涵盖#细胞株构建、#细胞培养、#纯化工艺开发、以及#分析方法开发等多个关键环节。通过瞬转测试提前明确双抗各链配比，从而在稳转细胞株构建过程中尽可能筛选杂质产生较少，难去除杂质比例较低的minipool及#单克隆细胞株。该体系在多个项目中得到了验证与应用，能够根据不同复杂抗体构型和功能机制灵活调整策略，从而实现更高的表达产率和更强的工艺稳定性。

参考资料：

[1] Zhen Fan, Bispecific antibodies for cancer therapy: evolution of structural formats and co-targeting strategies from wet-lab to AI-driven in silico modeling, Cancer Letters, Volume 653, 2026, 218578, ISSN 0304-3835, https://doi.org/10.1016/j.canlet.2026.218578.

[2] Liu Y, Peng H, Fan X, Liu X, Jiao G, Li J, Wang T, Fong SJ, Zhu L, Dai Y, Zhao Q. Artificial intelligence-assisted design of MAGE-A4 ×CD16 T-cell receptor-like natural killer cell engagers. MAbs. 2026 Dec;18(1):2717991. doi: 10.1080/19420862.2026.2717991. Epub 2026 Aug 31. PMID: 42675026; PMCID: PMC13532024.