01层析填料验证的重要性

层析工艺已经成为生物制药生产工艺中不可或缺的工艺步骤，而层析填料也因此成为生物制药中一个关键原材料。层析填料的相关验证是工艺验证中最重要，也是最复杂的一环，因为对它的验证跨越了工艺验证的所有阶段，包括工艺表征、工艺确认以及持续工艺确认。

一个典型的层析工艺涉及两个主要步骤，层析工艺操作步骤和层析工艺维护步骤。两个步骤的工艺参数都会对其所处理的产品的质量和安全性产生影响，因此，都需要在工艺验证中进行验证。

图1. 典型层析工艺的两个主要步骤及所需要的验证

02层析填料验证的内容

PDA技术报告14，柱层析工艺的验证，总结了层析填料所需要的研究/验证及规模要求。有些验证需要在商业化生产规模上进行，而有些则只能在缩小模型上进行。^[1]

表1. 层析填料验证的内容和规模要求

层析填料的工艺表征研究

层析填料工艺表征研究的目的是研究层析工艺操作参数对工艺性能/产品质量的影响，以确定关键工艺参数及其设定点和可接受范围。通常使用缩小模型进行前瞻性的研究。关于工艺表征相关的内容和知识可回顾Bio-Share系列文章（Bio-Share | 六步浅谈工艺表征主要过程）。

工艺表征研究的数据和结果将成为工艺控制策略的组成部分。工艺性能确认（PPQ）将确认该控制策略的可操作性和稳健性，从而为BLA申报奠定基础。

图2. 层析填料的工艺表征思路

需要注意的是，层析填料作为一个关键原材料，其批次间的变异性也是一个重要的变异源，需要纳入工艺表征中。这里可借用诸如稳健参数设计相关的思路。^[2]

层析填料的杂质清除与挑战性研究

生物制药工艺中层析填料对杂质的去除能力需要进行研究和确认。杂质去除能力要求要清楚的了解不同的层析工艺步骤对杂质的去除能力，这一般需要在PPQ运行期间追踪杂质的去除情况。

图3. 在PPQ批次上追踪不同工艺步骤对杂质（宿主细胞核酸）的去除情况

对于某些步骤，因为杂质含量低，或者分析方法的灵敏度问题，追踪杂质的去除并不能反映该层析工艺步骤的杂质去除能力，因此需要设计挑战性实验。因为需要将杂质引入层析工艺中，所以该挑战性研究只能在缩小模型上进行。

图4. 引入DNA杂质进行的挑战性实验^[3]

层析填料的寿命验证

PDA技术报告60-3，生物制药原液的工艺验证，强调了对层析填料维护步骤验证。该报告认为此部分的验证主要包括层析填料的寿命验证、清洁验证和保存验证。^[2]

层析填料的寿命验证是证明层析填料在其预期使用时间期限内能够维持其可接受的性能特征，并且可持续生产出符合质量标准的产品。层析填料的寿命验证需要在缩小模型进行，该缩小模型可使用工艺表征期间建立和确认的缩小模型，因为已经确认了它可以代表商业化规模的工艺。

层析填料寿命验证过程中还可以设计空白运行。PDA技术报告14中曾解释了空白运行的做法，即在正常的层析过程中，使用平衡缓冲液（或注射用水）代替上样的样品，其他工艺步骤则不变，收集洗脱部分进行检测。空白运行可以确认寿命验证期间残留物的累积效应。^[1]

图4. 层析填料寿命验证的数据展示（以步骤收率为例）

图5. 层析填料寿命验证中的空白运行（非还原SDS-PAGE的银染结果）

层析填料的清洁验证

清洁验证的目的是证明清洁程序能够将层析填料批次使用之间的残留物的量最小化。层析填料的清洁程序的开发一般在缩小模型上进行，而清洁程序的验证则通常需要综合使用缩小模型和商业化规模。

缩小模型的清洁验证是与上述层析填料的寿命验证同步进行，但是缩小模型对清洁程序的代表性还是有一定缺陷，因此还需要商业化规模上的数据来验证清洁程序的有效性，而这可以伴随着工艺性能确认（PPQ）来进行。

层析填料的清洁验证可使用淋洗水方法或空白运行方法。检测的项目则包括TOC、总蛋白以及一些特定工艺相关杂质，比如宿主细胞蛋白和宿主细胞核酸等。可接受标准的话，一般采用行业标准，比如10PPM（TOC）。不过企业也可以自行设定标准，尤其是对于特定的工艺相关杂质。

层析填料的保存验证

尽管层析填料的供应商可以提供填料的保存时限、保存液的抑菌和抑真菌等数据，但是仍然需要进行一定的层析填料保存验证工作。主要是因为供应商提供的层析填料保存数据是使用新鲜填料，并且在散装保存条件下进行。

大多数生物制药的实际生产中，保存的层析填料往往是使用过的，而且很多时候是柱上保存。层析填料的保存验证应当考虑到这些实际条件。下面展示了一个层析填料保存验证的可操作性示例。

表2. 层析填料的保存验证的示例

保存验证的结果可支持本公司使用相同层析介质的多个产品项目。

03层析填料的持续工艺确认

在获得BLA注册批准后，需要制定一个层析填料的持续工艺确认方案，以确认在商业化规模上，层析填料一直处于验证过的受控状态，比如层析填料的寿命、杂质去除、残留物累积、病毒去除等。

对于层析填料的寿命，应持续监控步骤收率、工艺相关杂质以及产品相关杂质，确认层析填料及其工艺性能处于寿命验证的状态之内。对于清洁状态，也需要持续的监控清洁工艺参数来确认。可以进行商业化规模的空白运行，比如每10个生产批次进行一次，以此持续确认清洁工艺的有效性。

除此之外，还应建立变更控制程序来记录和实施层析填料受控状态的变更情况。

04总结

层析填料的相关验证跨越了工艺验证的全生命周期，并且综合了缩小模型与商业化规模以及前瞻性验证与同步验证。因此，本文总结了关于层析填料相关验证的内容，符合行业操作实践，同时也能符合监管期望。

康日百奥生物科技（苏州）有限公司作为一家专业的生物药CDMO服务供应商，拥有强大的工艺开发团队，在工艺表征和工艺验证的项目上都拥有丰富的知识积累及充足的实战经验，保证客户项目的顺利交付。团队成员已经帮助多家国内外知名公司成功转移、放大和生产2000 L的临床和商业化产品，同时具有丰富的药品申报上市经验，其中包含多批具有较高技术难度，从3 L直接放大至2000 L的生产项目，成功率100%。

参考文献

1 PDA Technical Report NO 14 Validation of column-based chromatography processes for the purification of proteins. 2008

2 PDA Technical Report NO 60-3: Process Validation: A Lifecycle Approach Annex 2: Biopharmaceutical Drug Substances Manufacturing 2021

3 DNA spike studies for demonstrating improved clearance on chromatographic media Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 6938–6945