截至2025年7月，全球已有20款#双抗 获批（图1）。其中大多数为癌症免疫疗法，少数用于治疗慢性炎症及血液疾病。目前还有200多种双抗在开展临床试验，用于放射性免疫治疗、抗病毒（如埃博拉）、神经治疗（如阿尔茨海默病）及实体瘤癌症治疗^[1，2，3]。

图 1 全球双特异性抗体批准情况（2009–2025）

双抗具有多种作用机制（MoAs），如细胞桥接（如 mosunetuzumab-axgb）、血液凝血因子桥接（如 emicizumab-kxwh）、受体激活或阻断（如 ozoralizumab 和 faricimab-svoa）、受体或配体的内吞或聚集、辅因子模拟（如 emicizumab-kxwh）、以及重定向细胞毒性效应细胞。

图2 双抗研究的热门靶点分布

不同的作用机制和靶点需求演化为多种双抗分子结构，这些结构多样性直接决定了双抗在理化性质（如分子量、等电点、电荷异质性、聚集倾向）上的复杂表现。

双抗的关键理化属性涵盖蛋白序列与分子大小、空间构象（二级/三级结构）、疏水性、电荷特征、等电点、翻译后修饰（如糖基化、脱酰胺、氧化等）以及分子结构形式（如对称性与聚集状态）等。目前已报道超过100种双抗结构形式和30多种技术平台。选择何种结构形式（如 IgG 或抗体片段）主要依据分子的治疗用途、作用机制（MoA）、功能性和可开发性。

双抗分子在结构、理化性质及功能上的多样性，决定了其工艺开发需要采用针对性的策略，以确保产物质量、稳定性及可放大性。尽管前期对目标分子结构的合理设计可在很大程度上减少轻重链错配等问题，但仍难以彻底避免。因此，作为工艺开发的起始环节，细胞株构建在实现目标蛋白的高效表达、轻重链的准确组装及后续工艺放大过程中，发挥着关键作用。

在抗体表达过程中，尤其是面对双抗这类结构更复杂的分子，如何实现轻链与重链的协调表达、提高产量并保证正确折叠，是影响上游开发效率的关键因素。已有研究表明，通过优化表达载体结构，尤其是启动子组合的设计，可以有效提升抗体的表达质量与产量。比如，一项^[4]使用双启动子单质粒系统表达全长 IgG 的研究显示，将两个增强型 CMV（eCMV）启动子以对称方式构建于同一质粒内，不仅能实现轻链优先表达、提高正确装配率，还在 Expi293-F与 ExpiCHO-S 细胞中显著提升了蛋白表达水平。相比传统双质粒系统，该策略在表达效率、操作简便性与产物一致性方面均具有优势，为双抗等复杂抗体的表达优化提供了借鉴路径。

为实现重链与轻链的同步表达，研究构建了一个包含双向启动子（BiDi）的模块化载体。图3C展示了通过 Golden Gate 克隆后，重链与轻链基因被插入至同一质粒上，分别由对称排列的两个 eCMV 启动子驱动，实现共表达。图3D为 IgG1 抗体的结构示意图。

图3. 双启动子单质粒系统及其表达产物示意图

如图4所示，经过启动子组合优化后的2xeCMV 系统在 Expi293-F 细胞中实现了最高的抗体表达水平，相比传统设计提高显著。这一结果直观地表明，通过载体结构的合理调控，能够有效提升抗体分子的表达效率。

图4. 不同双启动子组合对抗体表达水平的影响

为评估系统的普适性，研究进一步在 κ型抗体 Durvalumab 与 λ型抗体 Avelumab 中对比2xeCMV 与传统双质粒系统的表达效果。图4显示，两种抗体在不同系统中的表达量相近，表明该单质粒系统不依赖轻链类型，适配性强，适用于多种抗体格式，包括双抗。

图5. 双启动子单质粒系统在不同抗体轻链类型中的表达通用性验证

以上是对于传统单抗进行的单质粒试验，除了对于双启动子单质粒构建研究，对于一些双抗来说，也有研究^[5]尝试通过对转染不同数量的表达载体进行优化，来提高转染，表达效率。

图6. 不同质粒构建策略

为了实现双特异性抗体（BsAb）四条链的协调表达，研究中比较了三种不同的质粒构建策略（见图6A）。传统方法通常采用四质粒系统，即分别转染两条重链和两条轻链的质粒，但操作复杂、表达比例难以控制。为简化流程，研究团队构建了双质粒系统（Dual vector），每个质粒编码一对 HC 和 LC，并进一步发展出单质粒系统（Quad vector），将全部四条链整合至一个质粒中（图6B）。

单质粒系统设计中，每条链具有独立的启动子和信号肽序列，且整合有一个 GS 选择标记，从而使该质粒不仅可用于瞬转表达，也适用于稳转 CHO 细胞株构建。该设计简化了转染操作，避免了多质粒系统中由于转染比例不当带来的链错配问题。

此研究中比较了 Dual vector 与 Quad vector 在 CHO 细胞中表达双特异性 IgG 型抗体的性能。结果显示，尽管在瞬转表达体系中，两者在抗体表达水平和装配效率方面表现相近，但 Quad vector 在稳转 CHO 表达系统中展现出更高的装配正确率、更低的错配产物比例，以及稳定可控的表达性能。

因此，不论单载体，还是双载体，我们都可以针对分子本身物理化学特性，结合瞬转测试、高通量筛选方法，针对目标蛋白进行表达及筛选。同时在分子开发阶段，及早融入工艺开发流程，有助于从源头评估分子的表达可行性与工艺适配性，还能在设计阶段同步考虑下游放大与质控需求，从而实现分子设计与工艺开发的协同优化，提升整体开发效率与成功率。

载体方面的优化使得双抗的可开发性明显提升，另外在宿主细胞的工程化方面也为我们提供了一些新的思路。为探究链比例对 FabscFv-Fc 生产的影响，研究设计了一套基于内部核糖体进入位点（IRES）的多顺反子载体，通过调控载体设计实现三条多肽链的不同表达比例^[6]。当重链（HC）与 scFvFc 链以 1:1 比例表达，且轻链（LC）过量时，正确组装的目标产物产量最高。对比 IRES、多启动子介导的共表达，使用2A 肽共表达三条多肽链时，产物滴度最高，且正确组装的产物比例也最高。这些可通过基于重组酶介导的定点整合系统实现对各链比例的精准调控。

双抗分子在临床前开发阶段遇到的主要挑战主要有以下三个方面。第一，双抗分子为非天然存在，在表达量上存在一定的不确定性，从而影响其可开发性；第二，双抗分子的结构更为复杂，杂质种类更多，某些错配体与正确配对分子有着相似的理化性质，在下游工艺开发中遇到的挑战较大；第三，在细胞株构建阶段，不同链转染质粒的比例对错配体的产生有着较大的影响，不同双抗分子对载体系统的选择也不尽相同。

面对可能遇到的工艺问题，在我们的实际交付中，针对双抗、三抗等多特异性抗体在结构与表达方面的复杂性，我们逐步建立并完善了一套平台化的开发体系，涵盖#细胞株构建、#细胞培养、#纯化工艺开发、以及#分析方法开发等多个关键环节。通过瞬转测试提前明确双抗各链配比，从而在稳转细胞株构建过程中尽可能筛选杂质产生较少，难去除杂质比例较低的 minipool 及#单克隆 细胞株。该体系在多个项目中得到了验证与应用，能够根据不同复杂抗体构型和功能机制灵活调整策略，从而实现更高的表达产率和更强的工艺稳定性。

参考文献

[1] Ma J, et al. Bispecific Antibodies: From Research to Clinical Application. Front. Immunol. 12, 2021: 1–19; https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.626616.

[2] Goebeler M-E, Stuhler G, Bargou R.Bispecific and Multispecific Antibodies in Oncology: Opportunities and Challenges. Nat.Rev. Clin. Oncol. 21(7) 2024: 539–560; https://doi.org/10.1038/s41571-024-00905-y.

[3] Bratt J, et al. Therapeutic IgG-Like Bispecific Antibodies: Modular Versatility and Manufacturing Challenges, Part 1.BioProcess Int. 15(11) 2017: 36–42; https://www.bioprocessintl.com/manufacturing/therapeutic-igg-like-bispecific-antibodiesmodular-versatility-and-manufacturingchallenges-part-1.

[4] Stefania C. Carrara. et al. Recombinant Antibody Production Using a Dual-Promoter Single Plasmid System. Antibodies 2021, 10, 18. https://doi.org/10.3390/antib10020018; 

[5] Yashas Rajendra et al. Transient and Stable CHO Expression, Purification and Characterization of Novel Heterodimeric Bispecific IgG Antibodies. Biotechnology Progress. DOI 10.1002/btpr.2414

[6] Ong HK, Nguyen NTB, Bi J, Yang Y. Vector design for enhancing expression level and assembly of knob-into-hole based FabscFv-Fc bispecific antibodies in CHO cells. Antib Ther. 2022 Oct 13;5(4):288-300. doi: 10.1093/abt/tbac025. PMID: 36518226; PMCID: PMC9743168.

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